Estudio comparativo en la investigación de Mycobacterium tuberculosis mediante la técnica de Ziehl Neelsen y Auramina O en pacientes del Hospital de Alta Especialidad de Veracruz SSA a partir de expectoración

Autores: et al , Bonilla Rojas Sashenka, Mora Domínguez Javier Paul, Portilla Cardenas Maria Dora, Castañeda Hernández Roberto Emilio, Deschamps Lago Rosa Amelia, Bolívar Duarte Laura Margarita, Aburto Herrera Reyna Esmeralda

Completo

Introducción
La tuberculosis en humanos es una enfermedad causada por bacterias del género Mycobacterium. La especie que se aisla con mayor frecuencia es M. bovis, seguida de M. tuberculosis y M. leprae. La enfermedad es clínicamente igual por cualquiera de las tres especies que la causan. El género Mycobaterium comprende bacilos aerobios estrictos con forma ligeramente curvada ó recta de entre de 0.6 μm × 1 a 10 μm. No son móviles y tampoco producen esporas. La pared celular de las micobacterias no se puede clasificar como Gram positiva o negativa. Debido a una característica del alto contenido de lípidos en forma de ácidos micólicos en la pared bacteriana, lo cual le brinda la propiedad de ser bacilos ácido-alcohol resistente (BAAR). El desarrollo de las micobacterias en medios de cultivo es muy lento si se compara con otras bacterias de interés clínico, las colonias se visualizan hasta 2 semanas o 2 meses de incubación2. Las especies ligadas a enfermedades se desarrollan de 2 a 6 semanas de incubación en el medio específico a temperaturas óptimas1, no obstante, existen micobacterias de crecimiento rápido (3-7 días)2. En la actualidad se conocen 100 especies del género Mycobacterium, las más conocidas son Mycobacterium tuberculosis y Mycobacterium leprae (causantes de la tuberculosis y la enfermedad de Hansen). Éstas no son las únicas de interés clínico, pero sí las más comunes y en el caso de Mycobacterium tuberculosis, la que causa millones de muertes al año1. La tuberculosis es una enfermedad infecciosa6, que se propaga mediante vía aérea y vías secundarias como: cutánea, congénita o por inoculación. Las personas infectadas expulsan secreciones que contienen el bacilo Mycobacterium tuberculosis, éstas llegan a personas sanas y dentro del nuevo hospedero y depende de la respuesta del sistema inmune de cada individuo, la cantidad de exposición y la virulencia de la cepa el desarrollar o no la enfermedad.6 La forma más común de la tuberculosis es pulmonar. Los bacilos entran por el tracto respiratorio y llegan a los alvéolos pulmonares. Al ser detectados por los macrófagos alveolares, en una persona con un sistema inmune competente, los macrófagos secretan interleucina 12 (IL-12) y factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α) y estas citosinas reclutan linfocitos T y células natural killer (NK) para activar la reacción inflamatoria. No obstante, en personas cuyo sistema inmune está deprimido, M. tuberculosis ingresa en el macrófago para multiplicarse intracelularmente, creándose granulomas: un conjunto de linfocitos, macrófagos diferenciados en histiocitos epitelioides7, fibroblastos y capilares, junto con fibrosis y encapsulación. Una vez formado el granuloma el bacilo puede ser eliminado, teniendo como consecuencia una calcificación intrapulmonar. También puede haber necrosis tisular la cual es menos organizada que los granulomas ya que están rodeados de fibrina para evitar que los macrófagos fagociten a la bacteria. La mayoría de los bacilos son eliminados, sin embargo, pueden quedar algunos dentro de los granulomas de manera que la infección vuelva a resurgir4. La tuberculosis no es exclusiva de los pulmones y se le conoce como tuberculosis extrapulmonar cuando afecta tejidos y órganos fuera del parénquima pulmonar. La bacteria se disemina vía hematógena y linfática. La tuberculosis extrapulmonar puede aparecer inmediatamente, después de semanas o años de la infección primaria. La baciloscopia es una técnica utilizada en infecciones tuberculosas pulmonares. Consiste en lectura al microscopio de los frotis previamente teñidos7 de muestras de esputo obtenido por expectoración natural7. Para que los bacilos sean detectables deben existir entre 10 000 y 100 000 bacilos/ mL en una muestra de esputo de entre 5 y 10 mL24. Para emitir un diagnóstico, esta técnica requiere de tres muestras: la primera cuando se identifique al paciente sintomático, y las demás al segundo día. En los pacientes controlados se debe examinar una muestra mensual durante el tratamiento. Las muestras deben ser expectoradas en espacios abiertos para evitar la propagación, la cantidad debe ser de 3 a 5 mL depositado en un recipiente estéril correctamente etiquetado. Un experto tarda 5 minutos en la lectura de cada frotis, examina 100 campos. Los resultados se obtienen con la proporción de número de bacilos entre número de campos y se reportan con cruces (+). Una muestra se reporta negativa cuando no se observan bacilos ácido-alcohol resistentes en 100 campos, se escribirá el número de bacilos si se encuentran de 1 a 9, una cruz (de 10 a 99 bacilos) en 100 campos observados, dos cruces para uno a diez bacilos por campo en promedio en 50 campos observados y tres cruces para más de 10 bacilos por campo en 20 campos observados10.Para la detección del bacilo existen múltiples técnicas, sin embargo, las más recomendadas son las tinciones debido a su bajo costo, fácil accesibilidad y rapidez1. Las tinciones se basan en la composición de la pared celular de las bacterias y permite identificar al bacilo en sujetos que expectoran > 5000 células bacterianas/ml. Sin embargo para tener una mayor eficacia se deben solicitar tres muestras del paciente sintomático. La tinción más utilizada es los laboratorios clínicos es la de Ziehl Neelsen, pero también es importante realizar técnicas más sensibles como las flourocrómicas (auramina-rodamina12). Otros métodos son el cultivo en medio Löwenstein-Jensen donde se observa el crecimiento en un lapso de 1 a 3 meses incubado a 37°C para el desarrollo las cepas de M. tuberculosis. Así mismo, hay técnicas moleculares de amplificación de ácidos nucleicos, muy sensible y específica al complejo que forma M. tuberculosis, además de su posible resistencia a la rifampicina, fármaco usado en su tratamiento. Ambas técnicas no son utilizadas debido al alto costo, el tiempo y el alto riesgo a la salud de exposición sobre todo de los cultivos15.
Morfología de los Bacilos acido alcohol resistente (BAAR)N La morfología de los BAAR en las tinciones no permite dife- renciar entre especies de micobaterias. No obstante, guar- dan ciertas características. M. tuberculosis presenta una for- ma alargada y homogeneidad en la coloración; M avium se presenta como bacilos muy cortos y con tinción uniforme; M. kansasii como bacilo acebrado, mientras que Mycobac- terium fortuitum y Mycobacterium chelonae presentan múl- tiples formas. Cabe mencionar que la morfología de las mi- cobacterias se ve afectada con tratamiento farmacológico.

Causas de falsos positivos
Generalmente, las razones por las cuales se generan falsos positivos en la detección de BAAR se debe a la falta de experiencia del personal al reportar como BAAR acumulaciones de pigmentos por fisuras en portaobjetos o la precipitación del reactivo. Así mismo, es posible la observación de BAAR pero no tratarse de M. tuberculosis sino de Myco bacterium no tuberculoso (MNT) los cuales son saprofitos o colonizantes del paciente.

Causas de falsos negativos
Contrario a lo anterior, los falsos negativos se pueden deber a que los frotis son gruesos o muy delgados o a desprendi- miento del mismo por calor excesivo. Cuando se utiliza la tinción con fluorocromos es importante cuidar el tiempo de exposición a la luz para evitar la pérdida de fluorescencia. Hay que tener en cuenta que al hacer una extensión del material en el portaobjetos para la realización de la baciloscopia se utilizan 0,01 ml. Cuando en 1 ml de esputo hay un millón de BAAR la baciloscopia siempre suele ser positiva mientras que si hay 10.000 BAAR sólo es positiva en el 60%. La sensibilidad claramente disminuye cuando el nº de BAAR/ml de esputo es menor.

Técnica de tinción Auramina O
La auramina O es un clorhidrato obtenido de la combina- ción de 4,4’-carbonimidoilbis(N,N-dimetilanilina) con ácido clorhídrico. Tiene un peso molecular de 303.8 g/mol y propiedades fluorescentes10. (Figura 1)  La tinción de auramina O (AO) está basada en la fluo- rescencia. Algunos estudios han demostrado que la AO es más sensible que la tinción de Ziehl Neelsen2, ya que pue- de detectar aproximadamente de 5 a 10% más frotis de bacilos ácido-alcohol resistentes positivos3. Al igual que en Ziehl Neelsen, la AO se une a los ácidos micólicos presen tes en la pared celular de las bacterias, las cuales fluorescen de color amarillo brillante ante un fondo oscuro11 debido a la propiedad de fotooxidación que posee la AO12. Para esta técnica es necesario además, microscopía fluorescente LED11. Una de las ventajas es que sólo se observan los baci- los ácido-alcohol resistentes, no se muestran las células, ni otras bacterias negativas para la tinción (Figura 2)11

Técnica de tinción Ziehl Neelsen
La tinción de Ziehl Neelsen permite la identificación de bacterias ácido-alcohol resistentes (BAAR). Es una técnica estandarizada que utiliza tres reactivos: Carbol Fucsina Fenicada (Fucsina Básica) Fig. 3. 12 (compuesta por fucsina básica, alcohol de 95°, fenol acuoso y agua destilada)13; solución de Azul de Metileno al 1% y solución de alcohol ácido14 (ácido clorhídrico y alcohol de 95°)15 El fundamento de esta técnica se basa en añadir carbol-fucsina alrededor de todo el portaobjetos y calentar la preparación ligeramente hasta el desprendimiento de vapores sin secar la preparación para solubilizar las ceras, lípidos y otros ácidos grasos de la pared celular y permitir el paso libre del colorante, ya que posee una gran afinidad por los ácidos micólicos que conforman la pared celular. Al enfriar con agua corriente y los componentes de la pared se vuelven a integrar, resistiendo a la acción abrasiva del alcohol-ácido. El azul de metileno funciona como colorante de contraste14 . Al microscopio óptico, se observan los bacilos de tuberculosis de color rosa, mientras que las bacterias que no son ácido-alcohol resistente y las células epiteliales se observan de color azul. Fig 4. Una desventaja de esta técnica de tinción es la aplicación de calor, ya que de no realizarla en condiciones óptimas ocasiona cambios fisicoquímicos o la formación de agregados del colorante de manera que se puedan dar falsos positivos o negativos15 

Metodología
Se realizó un estudio transversal, descriptivo y observacional con 56 muestras de baciloscopia de pacientes del Hospital de Alta Especialidad de Veracruz con diagnóstico probable de tuberculosis pulmonar, a los cuales se les solicitaron tres muestras de expectoración.Las muestras se transportaron al área de bacteriología para su procesamiento. A cada una se le realizó la tinción de Auramina O y la de Zielhl-Neelsen como describió anteriormente. Las siguientes tablas muestran la forma en que se deben reportar los resultados en las dos técnicas de acuerdo con lo observado :

Resultados
De los 56 pacientes incluidos en el estudio, 26 (43.4%) fueron positivos a ambas técnicas y 30 negativos. Con respecto al sexo 21 hombres que equivalen al 80.7 % fueron positivos y sólo 5 mujeres (19.3%). Se describe la clasificación de resultados positivos y negativos por grupos de edad y sexo (Cuadro 1).

Discusión
La tuberculosis es una enfermedad infecciosa seria de fácil propagación y alta prevalencia, actualmente considerada una pandemia global. Esta enfermedad se presenta con mayor frecuencia en estándares sanitarios pobres y de zonas sin medidas de saneamiento ambiental. En términos generales se estima que un tercio de la población mundial está infectada por el bacilo de la tuberculosis. Los métodos diagnósticos para este padecimiento deben ser realizados con precaución debido a las diferencias en el muestreo, la selección de estrategias y los métodos de laboratorio utilizados, tanto en los procedimientos de frotis y cultivos, los cuales al ser comparados directamente requieren cierta habilidad en la identificación. Algunas de las técnicas no son prácticas por los costos, por lo que es importante la implementación de técnicas de tinción como la de Auramina O (AO), la cual está basada en la fluorescencia y ofrece una visibilidad clara en la interpretación del frotis. Es indiscutible que el diagnóstico del paciente con tuberculosis pulmonar requiere una rápida atención médica, ya que de eso dependerá el éxito del tratamiento, por lo que es necesario contar con técnicas sensibles y específicas. Una de las ventajas que tiene la tinción de Auramina O con respecto a la de Ziehl Neelsen, es que sólo se observan los bacilos ácido-alcohol resistente, lo cual facilita el diagnóstico y evita los falsos negativos y postivos. Veracruz es el estado donde se presentan el mayor número de casos con tuberculosis pulmonar con o sin VIH, por lo que el diagnóstico oportuno garantiza su gran utili- dad favoreciendo a la población que lo requiere. Sin embargo tal vez una limitante para algunos laboratorios es el no contar con el microscopio de fluorescencia y que el manejo del reactivo de la Auramina O debe ser realizado con todo precaución para evitar los efectos adversos que podría producir al personal de salud a cargo, aunado a lo antes descrito tiene un costo menor en comparación con la tinción de Ziehl Neelsen. 


Conclusiones
De acuerdo a los resultados obtenidos podemos concluir que en la presente investigación, debido al tamaño de muestra que fue a conveniencia no pudimos observar lo reportado en la literatura sobre la mayor sensibilidad y especificidad de la técnica de Auramina O (5-10%) que la técnica de Ziehl-Neelsen. Es importante considerar que se requiere de un microscopio de fluorescencia, a diferencia de la baciloscopia realizada por el método de Ziehl Neelsen la cual es la más utilizada y considerado el método más barato. Otra desventaja de la Auramina O es que durante la realización de la técnica hay emisión de vapores, los cuales pueden afectar la salud del personal que la realiza. Cabe mencionar que el diagnóstico de certeza se establece con el aislamiento en cultivo de Lowenstein Jensen para la identificación de M. tuberculosis a partir de muestras clínicas. La utilización sistemática de medios de cultivo líquidos ha aumentado su sensibilidad y rapidez así como también se ha logrado que se aislen con mayor frecuencia micobacterias no tuberculosas de las cuales se desconoce su significado clínico. Otro método es por biología molecular obteniendo los ácidos nucléicos del M. tuberculosis y otras micobacterias pero requieren equipos y espacios adecuados para la realización del procedimiento
 

Palabras clave: Tuberculosis bacilo pulmonar Auramina O sensibilidad.

2021-09-03   |   1,965 visitas   |   Evalua este artículo 0 valoraciones

Vol. 15 Núm.1. Enero-Junio 2020 Pags. 96-101 Rev Invest Cien Sal 2020; 15(1)