Completo

Introducción
Recientemente el sulfuro de hidrogeno (H2S) se ha destacado como un nuevo miembro de la familia de los gasotransmisores.(1) La biosíntesis de H2S se lleva a cabo por dos enzimas: cistationina-β-sintasa (Cys4p) y cistationina-γ-liasa (Cys3p), juntas constituyen la vía de transulfuración, la cual convierte la metionina dietética en cisteína. (2) El H2S en concentraciones sub-toxicas regula diversos eventos fisiológicos, uno de ellos es la respuesta a proteínas mal plegadas (UPR). El incorrecto plegamiento de proteínas y su acumulación en el retículo endoplásmico se conoce como estrés de retículo endoplásmico (ERE).(3) Éste último es regulado por H2S a través de la inactivación de la fosfatasa PTP-1B, al persulfurar un residuo específico de cisteína, lo que conlleva que se impida la desfosfori lación de la proteína PERK, proteína asociada ERE.(4) La producción y regulación del H2S en diversos eventos fisiológicos no se conoce del todo y nunca se ha estudiado su papel en levadura. Objetivo: Determinar la participación de Cys3p y Cys4p en respuesta a estrés de retículo endoplásmico (ERE) de Saccharomyces cerevisiae.

Material y métodos
Reactivos: Los reactivos empleados en los protocolos y técnicas descritos en el presente trabajo fueron obtenidos de la marca comercial Sigma-Aldrich S.A de C.V (México) y fueron usados sin mayor purificación. Cepas: La cepas utilizadas se construyeron en el fondo BY4742 usando PCR y recombinación homóloga, confirmadas por PCR y secuenciación. Cepa ?cys3: genotipo MATα, his3?1, leu2?0, lys2?0, ?cys3. Cepa ?cys4: genotipo MATα, his3?1, leu2?0, lys2?0, ?cys4. Como control se utilizó la cepa BY4742. Medios: YPD (Extracto de levadura 1%, Peptona 2%, Dextrosa 2%, Agar2%). Medio mínimo (Bases nitrogenadas de levadura 0.17%, Dextrosa 2%, Sulfato de amonio 0.5%, Agar 2%, Solución de aminoácidos 1x). Solución de aminoácidos met -cist 10x (g/L): Adenina 0.2 g, Arginina 0.2 g, Aspargina 0.1 g, Acido glutámico 1.0 g, Leucina 0.6 g, Lisina 0.2 g, Fenilalanina 0.5 g, Serina 3.75, Treonina 2.0 g, Triptofano 0.4 g, Tirosina 0.3 g, Valina 1.5 g, Uracilo 0.2g. Concentrados 100X de Metionina y Cisteína: 20mg/mL. Fenotipificación por técnica de goteo: Se cultivaron las cepas BY4742, ?cys3 y ?cys4 en tubos Durham con 5 mL de medio YPD, (30°C, 24 horas). Posteriormente se midió la DO de los cultivos y se realizaron diluciones hasta una DO de 1. De cada dilución se realizaron 5 diluciones seriadas (1:10) y se agregaron 5 µL de cada una a medio sólido. Se dejó en reposo durante 1 h y posteriormente se incubó a 30°C por 3 días.

Resultados
La función canónica de las enzimas cistationina β-sintasa (Cys4) y cistationina γ-liasa (Cys3) es la síntesis de cisteína, por ello se probó la auxotrofia a cisteína de las cepas de este estudio, las cuales tienen deleciones en los genes de dichas enzimas. Se confirmó que estas mutantes no pueden crecer en ausencia de cisteína (Figura. 1A). Estas enzimas producen H2S, el cual se ha reportado como un regulador del ERE; por ello se evaluó la supervivencia de las cepas bajo condiciones de ERE inducido por tunicamicina. La mutante de Cys4p (Δcys4) resultó sensible a tunicamicina, mientras que la mutante de Cys3p (Δcys3), la cual realiza el segundo paso metabólico para la síntesis de cisteína no aparenta ser sensible a estrés (Figura. 1B). La metionina y la cisteína son aminoácidos azufrados que participan en la síntesis de proteínas; el primero como aminoácido iniciador y el segundo en la formación de enlaces disulfuro, cruciales en el plegamiento y estructura de las proteínas.(5) Aunque la ausencia de los genes encargados de la síntesis de cisteína pudiera comprometer la producción de proteínas por los niveles insuficientes de este aminoácido, las cepas Δcys3 y Δcys4 crecieron sin di ficultad en el medio completo YPD sin tunicamicina. Se evaluó la supervivencia frente a tunicamicina al adicionar en el medio metabolitos relacionados con esta vía tales como metionina (sustrato), cisteína (producto) y glutatión (producto obtenido a partir de cisteína y con potencial antioxidante); sólo la cisteína (2 mM) permitió recuperar el crecimiento de Δcys4 frente a tunicamicina (Fig. 1C). Se ha sugerido que, en levaduras, la recuperación de ?cys4 por la adición de cisteína ante ERE puede deberse a un aumento de la expresión del gen KAR2 lo cual podría favorecer la activación de la UPR. (6, 7).

Conclusiones
Se requiere de Cys4p para responder ante el estrés de retículo endoplásmico, ya que sólo la mutante ?cys4 de Saccharomyces cerevisiae es sensible a tunicamicina. La adición exógena de cisteína permite recuperar el crecimiento de esta mutante frente a tunicamicina, probablemente debido la participación de metabolitos de la vía de la transulfuración en la respuesta a proteínas mal plegadas.

Agradecimientos
Programa de apoyo UNAM-DGAPA-PAPIIT proyecto IA200315 y IA202217. CONACyT donativo al proyecto CB214-238681

Palabras clave: Saccharomyces cerevisiae cistationina β-sintasa tunicamicina retículo endoplásmico UPR.

2021-09-18   |   313 visitas   |   Evalua este artículo 0 valoraciones

Vol. 14 Núm.1. Enero-Junio 2019 Pags. 59-61 Rev Invest Cien Sal 2019; 14(1)