Resumen

La histidasa de hígado de rata se expresó a partir del producto de amplificación por PCR de la región codificante del DNAc de la histidasa, el cual se clonó en el vector de expresión pRSET. La construcción (pRSET-HAL) permitió la producción de una proteína de fusión que contenía una cola de polihistidinas. El producto de expresión se purificó con una resina que contiene Ni+, la cual retiene proteínas con fragmentos de polihistidina. El pRSET-HAL se analizó por medio de un análisis con enzimas de restricción y por secuenciación de DNA para confirmar su correcta orientación así como también su secuencia nucleotídica. La histidasa nativa hepática fue también purificada y tuvo un Mr de 72 kDa. A partir de la enzima purificada nativa se preparó un antisuero contra la histidasa en conejo. El análisis por Western blot mostró una sola banda de 72 kDa en membranas que contenían histidasa purificada o en la fracción citosólica de hígado de rata. El mismo anticuerpo también detectó en lisados de E. coli transformados con el plásmido pRSET-HAL una sola banda de 74 kDa correspondientes a la histidasa recombinante antes de su hidrólisis con enterocinasa. Después de la proteólisis, el análisis por Western blot mostró una sola banda de aproximadamente 72 kDa correspondiente a la histidasa. Análisis cinéticos de la histidasa recombinante mostraron Km y Vmax similares a las observadas con la histidasa nativa.

Palabras clave: Histidasa hígado rata.

2004-04-01   |   1,130 visitas   |   Evalua este artículo 0 valoraciones

Vol. 56 Núm.1. Enero-Febrero 2004 Pags. 43-50 Rev Invest Clin 2004; 56(1)