Diagnóstico de la deleción DF508 en el gen CFTR a través de mutagénesis dirigida mediada por PCR

Autores: Roque María, Castellanos Mariana, Pott Godoy Clara, Pusiol Eduardo, Mayorga Luis S

Resumen

Introducción: La fibrosis quística se hereda en forma autosómica recesiva y se caracteriza por la obstrucción de conductos, principalmente en pulmón, páncreas y tracto genital. La enfermedad es causada por diferentes mutaciones en el gen regulador de la conductancia transmembrana de la fibrosis quística (CFTR), siendo la frecuencia de enfermos de 1 cada 2.000-2.500 nacidos vivos y de heterocigotas portadores, de 1 cada 20-25 nacidos vivos. Para determinar la mutación más frecuente en el gen CFTR, que es la delección de tres pares de bases (CTT) denominada DF508, hemos desarrollado la metodología del mutagénesis dirigida mediante PCR o PSM. Población: Siete individuos considerados posibles portadores de la mutación, por tener manifestación clínica o pertenecer a una familia con algún afectado, dieron su consentimiento para utilizar su ADN en la puesta a punto del método. Dos familias solicitaron el estudio genético. Una, con cinco integrantes, uno de ellos de 18 años con el diagnóstico clínico de FQ y otra con 8 integrantes, uno de ellos de 4 años de edad, con un diagnóstico clínico dudoso de FQ. Materiales y métodos: Se obtuvo ADN genómico a partir de sangre total y el mismo se amplificó por PCR con cebadores específicos para el exón 10. Luego, el producto de amplificación se incubó con la enzima de restricción Mbol a 37°C. Resultados: Para amplificar el exón 10 del CFTR se utilizó un cebador 5’ que introduce parte de la secuencia del sitio de corte para la enzima Mbol; ésta es completada en el alelo sano por el triplete CTT, pero no en el alelo afectado. El cebador 3’ se eligió para contar con un control interno de actividad enzimática. Este análisis genético nos permitió detectar la mutación en cinco individuos, uno de ellos homocigota. Conclusiones: La metodología es simple, específica, sensible y de bajo costo, evita corridas electroforéticas de alta resolución para detectar la diferencia de tres pares de bases del producto de amplificación y no requiere hibridación con oligonucleótidos aleloespecíficos.

Palabras clave: Fibrosis quística mutagénesis dirigida me-diante PCR sitio de restricción.

2007-09-07   |   2,037 visitas   |   Evalua este artículo 0 valoraciones

Vol. 98 Núm.5. Septiembre-Octubre 2000 Pags. 304-309 Arch Argent Pediatr 2000; 98(5)